【病理技术分享】影响固定质量的因素

• 病理学固定的主要目标是维持清晰的形态特征(Eltoum et al 2001a, 2001b; Grizzle et al 2001)。

• 固定是将某些化学试剂渗透到需要保存或制作切片的脏器或组织、细胞中，使其所含物质尽量保持在生活状态时的形态结构、位置及生物学特点。

①保持细胞与存活时的形态和结构相似。防止细胞在自身溶酶体酶的作用下溶解破坏，发生自溶;或因细菌繁殖引起组织腐败。

②保持细胞内特殊成分与存活状态时相仿。固定不但能沉淀或凝固组织内的各种成分和病理代谢产物,如蛋白质、脂肪、糖类、色素，也可使其他碳水化合物、无机成分及微生物等经过固定而保存下来，使其定位在细胞内的原有部位,有利于染色后确切定位。对于不同的物质应选用不同的固定液和固定方法。

③便于区别不同组织成分。组织细胞内的不同物质经固定后产生不同的折光率，对染料产生不同的亲和力,经染色后容易区别。

④有利于切片。固定液兼有硬化作用，能使柔软组织(如脑)的质地变硬也能使胶质物体固化，使细胞正常的半液体状(溶胶)变为不能逆转的固体状(凝胶),便于制片操作。

⑤保存抗原及脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acidDNA)、核糖核酸(ribonucleic acidRNA),特别是准备用于做免疫组织化学染色和核酸检测的样本，尤其重要。

1、单纯固定剂

（1）甲醛：

常用浓度为4%≈10%福尔马林。

优点：渗透力强、对组织收缩较小、能使组织硬化、固定的组织细胞核着色良好；

缺点：封闭抗原决定族、使用不当可形成福尔马林色素。

秀威 10%中性福尔马林组织固定液

（2）乙醇：

浓度以80%～95%最好。

优点：具有固定、硬化、脱水作用；

缺点：使组织变脆、收缩明显，易出现组织固定不均。

秀威 无水乙醇

（3）乙酸：

穿透力强，可使组织膨胀，一般不单独使用。

2、混合固定液   

在实际工作中较多使用混合固定液。其固定效果明显优于单一 成分的固定液。

（1）10%中性福尔马林固定液：

（2）乙醇-甲醛-冰醋酸（AFA）固定液：

甲醛（40%）100ml、95%乙醇850ml、冰醋酸50ml

1、及时固定，冷缺血时间<30min,越早越好。

2、甲醛浸透组织的速度大约2-5mm/24h,固定时间至少6-8h，最好12-48h，超过48小时可造成不良影响，如FISH失败。

3、固定液要充分,一般为组织体积的5-10倍。

4、要防止组织变形。

1、缓冲液和pH

在弱酸性环境中甲醛固定效果及交联作用会减弱，血色素代谢产物发生化学改变形成棕黑色不溶性双折射晶体色素。色素在pH值<5.7的环境中形成，且当pH在3.0至5.0范围内时色素形成量增多。福尔马林色素很容易被辨认，且一般不影响造血疾病患者继发大量血红蛋白的分解产物的诊断。这种色素在苦味酸酒精溶液中很容易被去除。为了避免福尔马林色素的形成，中性缓冲福尔马林是首选的甲醛基础固定剂。

乙酸和其他酸的作用主要是通过降低pH值破坏蛋白质的三级结构。缓冲液可使溶液维持在最佳pH值上。具体缓冲液的选择取决于固定剂和待分析物的类型。常用的缓冲液有磷酸盐，二甲胂酸盐，碳酸氢盐，重碳酸盐和醋酸。

• 福尔马林浸透的速度：

• 2-3 mm左右 / 24 小时(致密组织）

2、固定时间和标本大小

Medawar对固定剂扩散进入组织的因素进行了一些研究（1941）。他发现固定的深度（d）与固定（t）的时间平方根成正比。

公式为：d =k√t。

常数（K）是扩散能力系数，每个固定剂的扩散能力都是特定的。10％的甲中醛该系数为0.79，100％乙醇为1.00，3％重铬酸钾为1.33（Hopwood 1969）。

对于10mm的球体，直到52 或25小时后固定剂才会渗透到球体中心。重要的是要注意每个复合固定剂的各种成分渗透速度不同，因此标本应该越薄越好。  

• 致密组织福尔马林浸透的速度：

• 2-3 mm左右 / 24 小时

3、固定的温度

分子的扩散随着温度的升高而增加，因为温度高时分子活动和振动会加快。即甲醛的组织渗透率在较高温度下更快，因此微波炉被应用于甲醛固定中以提高温度和气体分子运动的速度，然而这需要考虑到安全问题（Grizzle & Fredenburgh 2001. 2005）。大多数化学反应在更高的温度中也发生的更迅速，因此甲醛可以更迅速地与蛋白反应（Hopwood 1985）。封闭的组织处理器内固定液的温度可略高于室温，有利于提高固定效果。

4、固定剂的浓度

固定剂的浓度由固定效果和溶解度决定。浓度10％以上的甲醛往往会导致组织硬化和收缩程度的增加（Fox et al 1985），而浓度低于70％的酒精不能使组织有效脱水。

5、固定剂的渗透压和离子组成

缓冲液和固定液的渗透压非常重要；高渗和低渗环境可分别导致组织收缩或膨胀。最好的方案是稍微高渗（400-450 mOsm）；然而， 10％NBF的渗透压应约为1500 mOsm。同样，无论渗透效果如何各种离子（Na+, K+, Ca2+, Mg2+）都会影响细胞的形状和结构。因此含这些离子的液体应尽可能是与组织等渗的。

6、固定剂的选择和应用

8、组织固定的方式和方法

标本必须切开/剪开/摊开固定。

固定标本的容器大小要合适、密闭。

秀威 标本袋系列

9、固定液的量要充足

固定液与组织体积比 (至少10：1)。

10、 组织固定的时间要合适

根据实验室情况而定，固定时间一般为8–48 小时。